其原理是在(zai)末端(duan)脫氧(yang)核糖核苷酸轉(zhuan)移酶(mei)（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的(de)(de)(de)作用(yong)下(xia)(xia)，在(zai)基(ji)因組DNA斷裂(lie)時暴(bao)露(lu)出(chu)的(de)(de)(de)3′-羥基(ji)（3′-OH）末端(duan)摻入生物素(su)（Biotin）標志的(de)(de)(de)dUTP，隨后通過(guo)Biotin與(yu)連接辣根過(guo)氧(yang)化酶(mei)的(de)(de)(de)鏈霉(mei)親和素(su)（Streptavidin-HRP）特(te)(te)異結(jie)合，在(zai)辣根過(guo)氧(yang)化酶(mei)底物二氨基(ji)聯苯胺（DAB）的(de)(de)(de)存在(zai)下(xia)(xia)，產(chan)生深(shen)棕色的(de)(de)(de)不溶(rong)物，從而(er)特(te)(te)異準(zhun)確地定位(wei)凋(diao)亡(wang)的(de)(de)(de)細胞。

本試劑盒可用于石蠟切片、冰凍切片和細胞樣本（細胞涂片或爬片）的凋亡原位檢測，檢測結果可在普通光學顯微鏡下直接觀察計數。
包裝清單：

產品(pin)組成(cheng)：

保存條件：

Streptavidin-HRP, 4℃, 其余試(shi)劑-20 ℃保存，一年有效。

操(cao)作步驟：

1、樣本處理：

a) 石蠟(la)(la)切片(pian)：經二甲笨、酒精脫蠟(la)(la)，復(fu)水。脫蠟(la)(la)應(ying)充(chong)分。

b) 冰凍切片：流水沖洗，去除OCT包埋膠后，用(yong)純水洗3次(ci)。

c) 細(xi)胞飛片(pian)：用組織固定液固定后，用PBS洗三次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)5分(fen)鐘。1% Triton X-100處理10分(fen)鐘，用PBS洗三次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)5分(fen)鐘。

2、蛋白酶消化

將1ul 試劑（A）50× Proteinase K稀釋于50ul PBS中，滴加到組織上，37℃孵育10-20分(fen)鐘(zhong)。消(xiao)化結束后，用PBS洗三次，每(mei)次5分(fen)鐘(zhong)。

3、封閉

用3%的(de)雙氧水（H2O2）室(shi)溫(wen)封(feng)閉10分(fen)鐘(zhong)(zhong)，封(feng)閉結束后用PBS洗三次(ci)，每次(ci)5分(fen)鐘(zhong)(zhong)。

4、陽性對照組織的處理

將組織用DNase I消(xiao)化，以獲得斷裂的DNA，即成(cheng)Tunel染(ran)色陽(yang)性(xing)的對(dui)照(zhao)。陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)組織也可(ke)以(yi)選(xuan)用小鼠的小腸組織切片。

將50 ul DNase I消化液滴加(jia)于組織上，37℃孵育10-30分鐘，消化結束后，用PBS洗三次，每次5分鐘。

5、連接:

連接(jie)反應前用50 ul Equilibration Buffer孵育標本5-10分(fen)鐘。孵育過程中按(an)下表配(pei)制(zhi)連接(jie)工(gong)作液(ye)。去除標本上的Equilibration Buffer后，直(zhi)接(jie)滴加50ul 連接(jie)工(gong)作液(ye)，37℃孵育1-2小時，染色結束(shu)后，用PBS洗(xi)三次，每次5分(fen)鐘。

6、標志

取1 ul 試劑（I）Streptavidin-HRP加入到50ul PBS 中，混勻后滴加至組織上，37℃避光孵育30分鐘，隨后用PBS洗三次，每次5分鐘。

7、顯色

取50 ul 試劑（J）DAB-A solution 與2.5 ul 試劑（K）DAB-B solution混勻后，滴加至組(zu)織(zhi)上，室溫顯色反應(ying)30秒至5分(fen)鐘(zhong)。顯色結束(shu)后，用PBS洗三次，每次5分(fen)鐘(zhong)

8、蘇木素復染

每組織上(shang)滴加(jia)數(shu)滴Mayer’s蘇(su)木素(su)染(ran)(ran)色(se)(se)液(ye)，染(ran)(ran)色(se)(se)1-5分鐘，隨后用(yong)自來(lai)水沖洗反藍，如(ru)蘇(su)木素(su)染(ran)(ran)色(se)(se)過深(shen)，可用(yong)1%鹽酸(suan)酒精溶液(ye)分化數(shu)秒，再次反藍；如(ru)蘇(su)木素(su)染(ran)(ran)色(se)(se)過淺(qian)，可用(yong)蘇(su)木素(su)再次染(ran)(ran)色(se)(se)，并延長染(ran)(ran)色(se)(se)時間。

9、封片觀察

經梯度酒精脫水，二(er)甲苯透明后，滴加(jia)中性樹膠，加(jia)蓋(gai)玻片(pian)封片(pian)，光學顯微鏡下觀(guan)察(cha)拍照。

注(zhu)意事項：

1、Proteinase K 消(xiao)化時(shi)間(jian)需要(yao)摸索，冰凍(dong)切片(pian) 10 min 左右(you)，石蠟切片(pian)時(shi)間(jian)應適當延長。

2、陰性對照體系(xi)：配制連(lian)接工作液(ye)時(shi)用純水替代TdT Enzyme。

3、連接(jie)與標志反應(ying)時應(ying)注意避光。

4、實驗過程中請穿戴手套、實驗服等，做好個人防護。

備注：

         產(chan)品信(xin)息可能會(hui)有優(you)化升級(ji)，請(qing)以(yi)實際標簽(qian)信(xin)息為(wei)準。

本產品僅供科研使用。請勿用于(yu)醫藥、臨床(chuang)診斷(duan)或(huo)治療，食品及化妝品等用途(tu)。請勿存放于(yu)普通(tong)住宅區。

為了您的安全(quan)和(he)健康，請在(zai)實驗(yan)過程中做好防護工作。