其(qi)原理(li)是在末端脫氧核(he)糖核(he)苷(gan)酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的(de)作用(yong)下，在基(ji)因組(zu)DNA斷裂時暴露(lu)出的(de)3′-羥基(ji)（3′-OH）末端摻(chan)入被(bei)Alexa Fluor 488染料標(biao)志的(de)dUTP，使凋亡的(de)細胞被(bei)標(biao)志上綠色熒(ying)光，從而可以用(yong)熒(ying)光顯微鏡或流(liu)式細胞儀(yi)檢(jian)測。

本試劑盒為直接熒光標志法的TUNEL染色，染色步驟簡便，應用范圍廣泛，可用于檢測冰凍切片、石蠟切片和培養細胞的凋亡情況。
包裝清單：

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒產品組成：

保存(cun)條件：

-20 ℃保(bao)存，一年(nian)有效。

操作步驟：

1、樣本(ben)處理：

a) 石蠟切(qie)片：經二甲笨、酒精脫(tuo)(tuo)蠟，復水。脫(tuo)(tuo)蠟應充(chong)分。

b) 冰凍切片：流水沖洗，去除OCT包埋膠(jiao)后，用(yong)純水洗3次(ci)。

c) 細胞(bao)飛片：用(yong)組織固定(ding)液固定(ding)后，用(yong)PBS洗三次，每(mei)次5分(fen)鐘(zhong)。1% Triton X-100處理(li)10分(fen)鐘(zhong)，用(yong)PBS洗三次，每(mei)次5分(fen)鐘(zhong)。

2、蛋白酶(mei)消化

將1ul 試劑（A）50× Proteinase K稀釋于50ul PBS中，滴加到組織上(shang)，37℃孵(fu)育(yu)10-20分(fen)鐘。消(xiao)化結束后，用(yong)PBS洗三次，每次5分(fen)鐘。

3、陽(yang)性對照組織的處理

將組織用DNase I消化，以獲得斷裂的(de)(de)DNA，即(ji)成(cheng)Tunel染色陽(yang)性(xing)的(de)(de)對(dui)照。陽(yang)性(xing)對(dui)照組織也可以選用小(xiao)(xiao)鼠的(de)(de)小(xiao)(xiao)腸組織切片(pian)。

將50 ul DNase I消化液滴加于組織上，37℃孵(fu)育10-30分鐘，消化結(jie)束后，用PBS洗(xi)三次，每次5分鐘。

4、Tunel標(biao)志染色:

Tunel標志染(ran)色(se)前用(yong)50 ul Equilibration Buffer孵(fu)(fu)育標本5-10分鐘。孵(fu)(fu)育過程中按下表配(pei)制Tunel染(ran)色(se)工(gong)作液。去除標本上的Equilibration Buffer后(hou)，直接滴加(jia)50ul Tunel染(ran)色(se)液，37℃孵(fu)(fu)育1-2小(xiao)時，染(ran)色(se)結束后(hou)，用(yong)PBS洗(xi)三次(ci)，每次(ci)5分鐘。

5、封片(pian)：

每組織上滴加一滴封劑，小心蓋上蓋玻片，避免產生氣(qi)泡。用(yong)吸水紙(zhi)吸去多余的封片劑。熒光顯微鏡(jing)下觀察。

注意(yi)事(shi)項：

1、Proteinase K 消化時(shi)(shi)間需(xu)要摸索，冰凍切(qie)片 10 min 左右(you)，石蠟切(qie)片時(shi)(shi)間應適(shi)當(dang)延長(chang)。

2、陰性對照體系：配制Tunel染色工作液時用(yong)純水替代TdT Enzyme。

3、懸浮細(xi)(xi)胞用離心(xin)的方(fang)法收集細(xi)(xi)胞，所有反應在離心(xin)管中進行，染色結束后，可(ke)在熒光顯微下(xia)觀(guan)察，也(ye)可(ke)以(yi)用流式細(xi)(xi)胞儀檢測(ce)。

4、Tunel標志染色(se)時應(ying)注意避光。

5、實驗過程(cheng)中請穿戴(dai)手套、實驗服等，做(zuo)好(hao)個人防護。